研究背景：
慢性肾小球肾炎（CGN），其特征在于蛋白尿，水肿，高血压，血尿是一种免疫介导的疾病，其占许多国家慢性肾病病例的约20％，是最常见的肾小球疾病。自噬是一种进化的保守和溶酶体依赖性蛋白质降解系统，可以消除细胞中受损或老化的细胞器和生物分子，维持细胞稳态。研究表明，自噬涉及各种肾病，急性肾病和肾纤维化，这可能作为一种治疗肾病的新方法。经典的PI3K/AKT途径调节许多慢性肾病发育过程，包括增殖和炎症，是慢性肾病中最常见的炎症，包括慢性肾小球肾炎。黄芪甲苷（As-IV），具有抗炎等药理作用。研究表明，AS-IV赋予慢性肾病治疗的潜在治疗益处，包括急性肾损伤，糖尿病肾病和肾纤维化。在目前的研究中，我们证明了自噬的激活抑制了肾脏中的乳腺细胞增殖和炎症浸润，并首先研究了在CGN大鼠和人乳房细胞（HMC）中对自噬的PI3K/AKT/AS的影响。此外，我们评估了AS-IV对上述CGN体内和体外模型的上述通路的保护作用。
结果一：AS-IV改善了CGN大鼠的肾功能和病理变化
如图1A所示的AS-IV的化学结构。尿蛋白是CGN最突出的特征之一。肾小球损伤通常伴随着大量的蛋白尿，这导致不可逆的肾小球损伤。在该研究中，图1B中示出了24小时尿蛋白的水平。与正常大鼠相比，C-BSA诱导的肾小球肾炎大鼠24小时尿液蛋白显示出的数据显着增加，而AS-IV治疗与模型组相比，尿蛋白显着减少。此外，图1C，D也显示出血清肌酐（SCR）和血尿尿素氮（BUN）的含量。数据表明，与正常大鼠相比，C-BSA肾小球肾炎大鼠表现出高水平的SCR和BUN。组织学变化的结果呈现在图1E，F，结果表现出正常大鼠中肾小球和肾小珠的薄膜胶囊，而C-BSA诱导的肾小球肾炎大鼠的严重病理损伤，主要显示出明显的炎症细胞浸润在肾小球基质中，除了肾小管上皮细胞的一部分中，存在粒状变性，肾小球中肿胀，基质中的胶原纤维明显增生。同时，PAS染色的结果表明，与正常组相比，C-BSA诱导的肾小球肾炎大鼠中光密度水平显着增加，并且通过IV处理改善了病理变化。IgG和C3的免疫荧光在图1G中显示，在模型组中，IgG和C3在毛细血管沿着毛细血管中表达，用苯那普利和不同剂量的AS-IV进行处理，IgG和C3的表达低于模型组，表明AS-IV可以改善CGN的免疫损伤。
结果二：AS-IV对CGN大鼠炎症和增殖变化的影响
测量C-BSA诱导的肾小球肾炎大鼠炎症和增殖变化，ELISA试剂盒用于检测肾组织IL-6和IL-1β的含量。此外，Western印迹值以重视Cyclind1的表达。我们发现，与正常组相比，来自C-BSA肾小球肾炎大鼠肾脏的IL-6和IL-1β的水平显着增加。有趣的是，AS-IV治疗表明，针对IL-6和IL-1β增加的显然保护（P.01）（图2A）。同时，在C-BSA诱导的肾小球肾炎大鼠中，Cyclind1（图2b）显着高于正常组中的那些，并且AS-IV降低了CyclinD1的表达（P.01）。为了确定CGN中细胞因子产生和增殖过程中PI3K/AKT/AS和自噬信号通路的相对作用，并确认PI3K/AKT/AS信号通路和自噬之间的关系，我们进行了Western印迹实验以检测表达该途径中的关键蛋白和自噬相关蛋白质。
结果三：CGN大鼠中PI3K/AKT/AS信号通路的变化
检测到包括PI3K，AKT，P-AKT，AS，P-AS的蛋白质的表达被检测参与PI3K/AKT/AS信号传导途径。如图3所示，与正常大鼠相比，CGN大鼠的PI3K，P-AKT，P-AS的表达水平显着增加。AS-IV处理显着下调PI3K的表达，AKT和AS的磷酸化。我们的结果表明，在CGN的过程中，激活PI3K/AKT信号通路，从而促进AS的磷酸化。有趣的是，AS-IV抑制了PI3K/AKT/AS途径的活性。
结果四：AS-IV对CGN大鼠自噬的影响
我们已经证明，PI3K/AKT/AS途径参与CGN的开发，接下来，我们照亮了CGN大鼠的自噬水平和自噬和PI3K/AKT/AS路径之间的串扰变化。透射电子显微镜证明了AS-IV治疗组中饲养的自噬体数。为了进一步确定肾组织中的自噬活性，检测到自噬相关蛋白LC3II，BECLIN1，P62的表达。此外，RAB14被认为在调节自噬活动方面发挥关键作用，该活动受到AS的调节，因此，还检测到RAB14的表达。LC3II和BECLIN1的表达水平降低，而CGN大鼠的P62增加。此外，rab14的表达增加。相比之下，AS-IV治疗增加了LC3II和BECLIN1的表达，这减少了P62和RAB14的表达（图4）。我们的结果表明，自噬抑制了CGN的发展，并且自噬可能受到PI3K/AKT/AS的影响。不陈旧的是，AS-IV治疗明显抑制了PI3K/AKT/AS的活性，并增强了CGN大鼠的自噬。
结果五：AS-IV对LPS诱导的HMCS增殖的影响
为了确定AS-IV对HMCS增殖的影响，使用Western印迹评估MTT测定和Cyclind1的表达。如图5A所示，与HMC的增殖速率相比，LPS显着刺激了HMC的生长，在10,20,40mg/mL的浓度下给予AS-IV导致LPS诱导的细胞生长显着抑制。WesternBlot显示Cyclind1的表达水平在LPS诱导的HMC中降低，但是通过AS-IV恢复（图5B）。
结果六：AS-IV对LPS诱导的HMCS的PI3K/AKT/AS通路的影响
与对照相比，我们注意到具有30μg/mlLPS处理组的PI3K，磷酸-AKT和磷酸-AS水平的显着增加。AS-IV治疗可防止LPS诱导的HMC中磷酸-AKT和磷酸-AS表达的增加（图6）。为了评估AS-IV对HMC中RAB14表达的影响，在体外测量RAB14的水平。在细胞处理后，RAB14的发现显着增加，用30μg/ml的LPS。与LPS处理基团相比，具有30μg/mLLPS和40ng/mlLy的LY的水平显着降低了RAB14的水平。此外，用AS-IV的处理也显着降低了RAB14的表达（图7B）。串联GFP-RFP-LC3腺病毒用于自噬流程的实时监测，MRFP用于标记以及痕量LC3，GFP的衰减表明溶酶体和自噬物体合并到自身溶解中。我们转染了HMC，以表达与串联GFP和MRFP融合的LC3。GFP荧光蛋白对酸敏感，当自噬体与溶酶体融合时，淬灭GFP的荧光，并且只能检测到红色荧光。从结果中，腺病毒被成功地引入HMCS。与模型组相比，自噬在Ly组中显着活跃，特别是自噬溶酶体（MRFP）。在AS-IV处理期间，自噬也上调，主要是由于自噬体（合并）的表达增加（图7A）。此外，在我们的模型中在AS-IV存在下测量LC3II，BECLIN1，P62的表达。根据动物研究，在与仅用LPS（图7C）处理的细胞相比，在经受IS-IV和LPS的细胞中观察到LC3II，BECLIN1表达和P62表达显着降低的显着增加（图7c）。
讨论：
在这项研究中，我们建立了C-BSA诱导的CGN模型，其与人CGN完全相似，并且被认为是一种经典免疫蛋白诱导的肾小球肾炎模型。此外，建立了Lps诱导的炎症和HMC的增殖，以研究有关CGN的异常增殖和炎症的可能机制。在CGN大鼠中检测到肾功能，病理变化，炎症和增殖变化。结果表明，CGN大鼠表现出显着的肾功能差异伴随着大量的24小时蛋白尿，肌酐和尿液异常的血液水平。CGN大鼠中炎症和增殖的迹象是显而易见的。在LPS诱导的人体髓细胞中，观察到不同的增殖。有趣的是，AS-IV衰减上述所有症状。然而，AS-IV的具体机制尚不清楚。研究表明，AS-IV有益于Type2糖尿病肾病，这可能与Akt途径的抑制相关（H.Sun等，）。但是，在CGN中尚不清楚。因此，我们调查了PI3K/AKT/AS途径的变化及其对RAB14和自噬的调节效果。
在我们目前的研究中，我们发现PI3K/AKT/AS途径在CGN大鼠和LPS诱导的人体髓细胞中被激活，通过表达PI3K和AKT和AS的磷酸化水平证明。PI3K/AKT/AS参与了Mesangial细胞的增殖。AS-IV治疗显着降低了P-AKT和P-AS的表达水平，它在PI3K/AKT/AS途径上表示AS-IV的抑制作用。接下来，我们测量肾组织和人髓细胞中RAB14的水平。结果表明，RAB14的表达增加。Ultoriotly，AS-IV降低了RAB14的水平。
为了确定CGN期间自噬的活性，我们检查了LC3II，BECLIN1和P62的表达。如所预期的，LC3II，BECLIN1的表达降低，P62的表达在体内和体外均增加。值得注意的是，结果显示了CGN期间自噬的活性令人沮丧。有趣的是，AS-IV的治疗废除了LC3II和BECLIN1的抑制作用，这证明了AS-IV在CGN期间增加了自噬水平。因此，靶向自噬信号可能对乳房细胞增殖和CGN的治疗有效。为了进一步研究CGN中PI3K/AKT/AS和自噬之间的关系，我们使用LY抑制PI3K/AKT/AS的活性。结果表明，用LY处理时，P62表达降低了BECLIN1和LC3II的水平。AS-IV治疗抑制过量激活PI3K/AKT/AS，从而激活自噬。统称，该数据突出了AS-IV对PI3K/AKT/AS途径和自噬的活性的影响，提供了对体内和体外的HMC增殖的保护。
总之，本研究表明，由于在体内和体外改变PI3K/AKT/AS自噬途径的活性，AS-IV对CGN的活性对CGN的异常增殖具有保护作用。基于AS-IV治疗的方法值得进一步调查作为限制CGN和末期肾病的进展的替代治疗策略。
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